吕叶香¹、邓格求¹、余鸿发¹、余敏²、高俊兰²、刘盛全²

（1、江门市红木检测有限公司；2、安徽农业大学林学与园林学院）

摘要 [目的] 评价三条DNA候选条形码序列对刺猬紫檀木材的鉴定能力。[方法] 以不同产地采取的刺猬紫檀木材为研究对象，提取并扩增核ITS2、叶绿体matK基因及叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32。采用BLAST和NJ树法评价不同DNA条形码候选序列的鉴定能力。[结果] ITS2序列具有最高的扩增和测序效率，ITS2序列的平均种间遗传距离也明显高于种内遗传距离。[结论] ITS2序列可以将刺猬紫檀木材与其他同属近缘紫檀属树种木材区分开来。

关键词：刺猬紫檀；DNA条形码；木材识别

 

DNA Barcoding for the Identification of Wood of Pterocarpus erinaceus Poir.

Abstract [Objective] To evaluate the species discrimination power of three candidate DNA barcoding locis for wood of Pterocarpus erinaceus. [Method] The wood of P. erinaceus originated from different sites in this study. DNA from the sapwood and heartwood of P. erinaceus was extracted. Three plant DNA barcodes were amplified, i.e., the nuclear DNA region ITS2, the chloroplast matK and the chloroplast intergenic spacer ndhF-rpl32. The identification ability of different sequences was evaluated by BLAST and NJ tree methods on Pterocarpus species resolution. [Result] ITS2 demonstrated the highest amplification and sequencing efficiency, and the mean of interspecific distances was higher than the mean of intraspecific distances. [Conclusion] The wood of P. erinaceus could be distinguished from other Pterocarpus species by using the rDNA-ITS2 sequences.

Key words: Pterocarpus erinaceus Poir.；DNA barcode；Wood identification

 

刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）为豆科紫檀属大乔木树种，主要分布于西非国家，是我国红木标准（GB/T18107-2000）中5属8类33种红木树种之一。刺猬紫檀叶片、树皮和树根具有重要药用价值，其内含提取物具有治疗慢性腹泻、抗疟疾和治疗肠道寄生虫感染等功效^[1]。刺猬紫檀常被用来制作高档家具和工艺品，深受消费者喜爱和追捧。这也造成了刺猬紫檀砍伐量激增，直接导致该树种野生资源日益枯竭。2016年，在南非约翰内斯堡举行的《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）第17次缔约国大会上，刺猬紫檀被列入濒危管制附录二。

传统的木材识别方法具有一定的局限性，难以将木材树种准确地识别到种的水平^[2]。随着研究水平和检测手段的不断发展和进步，在传统的木材识别技术的基础上，其他领域的分析方法开始尝试应用到木材识别和鉴定中，极大地丰富了木材识别与鉴定的手段^[3]。目前，国内采用红外光谱技术对于刺猬紫檀及其近缘种树种木材的识别研究较多^[4-6]，但采用DNA条形码技术识别刺猬紫檀木材的研究还未广泛开展。本研究以不同产地采取的刺猬紫檀木材为研究对象，提取并扩增核ITS2、叶绿体matK基因及叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32。采用BLAST和NJ树法评价不同DNA条形码候选序列的鉴定能力，以期为利用DNA条形码技术准确地识别刺猬紫檀及其近缘种木材提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究刺猬紫檀木材试样分别产自非洲西部七个不同的国家，样品信息和产地来源见表1和图1。所有木材试样在进行DNA提取前均需用无菌刀片切除木材表面部分，并将木材试样切成小片置于冷冻研磨仪中低温制备成粉末后备用。

表1 样品信息

Table 1 The detail of collected samples

 

 

 

 

 

图1 样品采集地

Fig. 1 Sites where the samples were collected

 

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及纯化

称取500 mg木材粉末置于50 mL无菌离心管中，使用DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Maxi Kit，QIAGEN）提取木材总DNA。由于木材DNA提取物中含有大量的PCR扩增抑制物，将严重干扰后续PCR扩增反应，需对木材DNA提取原液进行纯化处理。木材DNA纯化采用PCR扩增模板纯化试剂盒（High Pure PCR Template Preparation Kit，Roche）纯化DNA提取物。

1.2.2 DNA条形码序列的扩增、产物纯化及克隆测序

通过比较和分析GenBank已公布的紫檀属细胞核ITS2、叶绿体matK基因和叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32，设计三对DNA条形码序列扩增引物。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。三条DNA条形码序列扩增引物信息和反应体系见表2。PCR产物特异性通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（全式金）进行胶回收纯化回收，纯化回收后的DNA条形码片段克隆采用pEASY-T1 Simple Cloning Kit（全式金），并在固体LB平板中进行培养和蓝白斑筛选。将鉴定为阳性克隆重组子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，为保证测序结果准确性，每个样品选择5个独立的克隆重组子进行双向测序。

表2 DNA条形码PCR扩增引物和扩增反应体系

Table 2 Primer pairs of DNA region and reaction conditions applied for the PCR amplification tests in this study

1.2.3 DNA条形码序列的分析

测序结果采用Lasergene Suite 7软件进行正反向序列校对和拼接，去除引物两端载体序列。采用MEGA 5.0软件的Kimura two parameter（K2P）模型进行DNA条形码种间和种内遗传距离计算，统计序列的碱基组成、变异位点和信息位点等序列特征信息。采用BLAST方法对获得的DNA条形码序列在GenBank数据库中进行相似性同源搜索。将GenBank中与刺猬紫檀DNA条形码序列同源性序列较高的同属其他种序列（见表3）与本研究获取的DNA条形码序列一起采用邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统发育树，系统发育树各分支的置信度用自举检验法（boot-strap text）作1000次可信度分析。

表3 紫檀属序列GenBank登录号

Table 3 GenBank accession number of Pterocarpus species

2 结果与分析

2.1 PCR扩增和测序成功率

三条DNA条形码候选序列的PCR扩增和测序成功率结果如图2所示。ITS2序列PCR扩增成功率最高为93%，叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32最低为79%。核ITS2序列多拷贝存在于核基因组中，这可为降解为小片段的DNA扩增提供有利的条件和保证^[7]。由于在对木材DNA进行PCR扩增反应时，通常会出现非特异性扩增和低丰度扩增PCR扩增条带，如直接进行测序无法获得准确的结果或出现测序失败。为提高测序成功率本研究采用克隆测序的方法，结果显示三条DNA条形码候选序列的测序成功率均为100%。

 

 

图2 DNA条形码扩增和测序成功率

Fig. 2 PCR and sequencing success rates of the three DNA barcode loci

 

2.2刺猬紫檀种内及种间变异

通过对7个不同产地刺猬紫檀的三条候选DNA条形码序列进行多重比对，ITS2序列种内存在2个变异位点，其中168bp位点T颠换为A，196bp位点G转换为A，且这两个变异位点均来自于马里的CW021。通过BLAST同源性比对，不同产地的刺猬紫檀木材ITS2序列与GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083478）ITS2序列的最大相似度值为99%。7个不同产地刺猬紫檀的matK和ndhF-rpl32种内均为发现变异位点，且分别与GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083542和JN083598）的matK和ndhF-rpl32序列的最大相似度值为98%。

对本研究获得的刺猬紫檀以及GenBank下载的已公布的紫檀属其他不同种的三种DNA条形码的种间和种内遗传距离、碱基组成、变异位点和信息位点进行分析（表4）。结果表明，ITS2序列的GC含量最高为67%，叶绿体基因间隔区ndhF-rpl32序列的GC含量最低为27%。三条候选DNA条形码中，ITS2序列种间存在最多的变异位点和信息位点（图3）。此外，ITS2序列的平均种间遗传距离也明显高于种内遗传距离。

 

表4 三条DNA条形码序列特征

Table 4 The characteristics of the three DNA barcode loci

 

 

 

图3紫檀属木材ITS2序列种间序列变异位点

Fig. 3 The interspecific variable sites in ITS2 sequence of wood of Pterocarpus species

2.3刺猬紫檀及其同属近缘种NJ树聚类分析

本研究选取紫檀属种间变异较大的ITS2序列构建NJ树（图4），结果表明，不同产地的刺猬紫檀首先聚类为一支，bootstrap值支持率为100%，表现出明显的单系性，其他紫檀属树种各自聚类。因此，ITS2序列可以准确地将刺猬紫檀木材与其他同属近缘紫檀属树种木材区分开来。

 

 

图4 基于ITS2序列构建的邻接（NJ）树

Fig. 4 Phylogeny tree obtained by the neighbor-joining

analysis based on ITS2 sequence

3 结论

刺猬紫檀木材ITS2序列扩增和测序成功率最高，种间遗传距离大于种内遗传距离，基于ITS2序列构建的系统进化树能够成功地将刺猬紫檀木材与其他同属近缘紫檀属树种木材区分开来，但ITS2序列作为DNA条形码无法将不同产地的刺猬紫檀木材准确区分，对于刺猬紫檀木材产地溯源研究还需进一步深入研究。

 

参考文献

[1] Karou D, Dicko M H, Sanon S, et al. Antimalarial activity of Sida acuta Burm. f. (Malvaceae) and Pterocarpus erinaceus Poir. (Fabaceae)[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2003, 89(2):291-294.

[2] 刘金良, 伏建国, 杨晓军,等. 进口针叶木木材的DNA提取与分子鉴定方法[J]. 中南林业科技大学学报, 2012, 32(8):131-136.

[3] 高珊, 金鑫, 徐小玉,等. 木材的DNA鉴定技术综述[J]. 刑事技术, 2014, 39(5):49-51.

[4] 张妍茵, 顾玉琦, 张雯雅. 近红外光谱技术对红木家具的鉴别[J]. 安徽农业科学, 2017, 45(22):115-116.

[5] 张蓉, 徐魁梧, 张丽沙,等. 基于红外光谱的5种红木树种识别探讨[J]. 林业工程学报, 2014, 28(2):95-99.

[6] 程士超, 李丹, 张求慧,等. 5种花梨木的红外光谱比较分析[J]. 北京林业大学学报, 2016, 38(1):118-124.

[7] 余敏, 张浩, 刘盛全,等. 降香黄檀木材DNA提取及rDNA-ITS序列条形码分子鉴定[J]. 林产化学与工业, 2014, 34(5):103-108.